Гепатит с генотипы чем отличаются
Гепатит с генотипы чем отличаются
Молекулярно-генетическое исследование для определения генотипа вируса гепатита С.
Применяемый набор реагентов может быть использован для диагностики вируса гепатита С и наиболее распространенных на территории России генотипов HCV (1a, 1b, 2, 3a и 4) in vitro.
Вирус гепатита С (ВГС).
Hepatitis C Virus (HCV) Genotyping, HCV Subtype.
Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в режиме реального времени.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
Общая информация об исследовании
Вирус гепатита С (ВГС) способен поражать клетки печени, а также некоторые клетки крови (нейтрофилы, моноциты, В-лимфоциты). В основном инфекция передается через кровь (препараты для переливания элементов крови и плазмы, донорские органы, нестерильные шприцы, иглы, инструменты), реже вероятно заражение половым путем.
Острый вирусный гепатит, как правило, протекает бессимптомно и в большинстве случаев остается невыявленным. У 60-85 % инфицированных развивается хроническая инфекция, которая увеличивает риск развития цирроза, печеночной недостаточности и гепатоцеллюлярной карциномы. За свое скрытое, но разрушительное действие инфекция получила неофициальное название «ласковый убийца».
ВГС обладает наибольшей вариабельностью среди всех возбудителей вирусных гепатитов и благодаря высокой мутационной активности способен избегать воздействия защитных механизмов иммунной системы. Геномы вируса значительно отличаются в разных странах мира и имеют различную чувствительность к препаратам интерферонов.
Противовирусная терапия, направленная на подавление прогрессирования заболевания, в редких случаях может ускорить развитие осложнений со стороны печени. Это происходит при неправильной оценке клинических и лабораторных показателей. Генотипирование РНК вируса гепатита С позволяет спрогнозировать эффект от планируемой терапии.
Генотип 1 хуже поддается лечению, чем генотипы 2 и 3. Кроме того, биопсию печени важнее провести именно при генотипе 1. Повышенные дозы препаратов интерферона рекомендованы для пациентов с 1-м и 4-м генотипами. Курс терапии у таких пациентов должен быть продлен до 48 недель даже при отсутствии вируса в крови более 24 недель. В случае успешности лечения, которая подтверждается снижением вирусной нагрузки крови ( Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Референсные значения: РНК HCV не обнаружена.
При обнаружении указывается генотип:
Результат
Значение
Очень высокий риск хронизации инфекции и развития тяжелых осложнений. Необходимо лечение более высокими дозами интерферона в течение 48 недель.
В большинстве случаев в течение 24 недель достигается планируемый терапевтический эффект.
Труднее поддается лечению, требует доз препаратов, отличных от применяемых при терапии с генотипами 2 или 3.
Что может влиять на результат?
Вирусные гепатиты В и С: сходство и различие
В статье представлены данные по основным особенностям, характерным для вирусных гепатитов В и С, описаны различия в строении вирусов, внепеченочных клинических проявлениях, механизмы развития гепатоцеллюлярной карциномы, рассмотрены новые данные по против
The article presents data on the main features typical for viral hepatitis B and C, describes differences in the structure of viruses, extra-hepatic clinical manifestations, mechanisms for the development of hepatocellular carcinoma, considers new data on antiviral therapy and vaccination. The data of the original study of patients with chronic hepatitis B and C, in whom we assessed the function of the biliary tract, vegetative status and vegetative reactivity, content of tissue magnesium and zinc, are also given.
Вирусные гепатиты В и С, антропонозные инфекции с заражением через поврежденные кожные покровы и слизистые оболочки, относятся к числу повсеместно распространенных болезней и по праву занимают одно из ведущих мест в инфекционной патологии человека. Эти инфекции характеризуются тяжелым клиническим течением, являясь частой причиной хронического гепатита, цирроза и первичного рака печени.
Заболеваемость вирусным гепатитом С (ВГС) является проблемой международного масштаба, требующей безотлагательных действий. В 2015 г. в мире отмечено 1,75 млн новых случаев ВГС. По данным Всемирной организации здравоохранения в 2015 г. оценочное число лиц, живущих с ВГС, составило 71 млн, из них только 5% знали о своем заболевании, 1% получали противовирусную терапию [1]. В мае 2016 г. Всемирная ассамблея здравоохранения приняла «Глобальную стратегию сектора здравоохранения по вирусному гепатиту на 2016–2021 годы», включающую глобальные задачи по снижению заболеваемости вирусными гепатитами на 90% и сокращению случаев смерти из-за вирусного гепатита на 65% к 2030 г. [2].
Хронический гепатит В (ХГВ) в настоящее время остается одной из основных проблем здравоохранения как в Российской Федерации, так и во всем мире. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в 2017 г. в мире насчитывалось около 257 млн человек с ХГВ, причем около 70% из них проживают в Азии. Ежегодно, по данным ВОЗ, от гепатита В умирает 1 млн человек, этот показатель занимает первое место среди причин смерти больных с патологией печени [3]. Большинство летальных исходов были обусловлены хроническими заболеваниями печени, такими как цирроз печени (ЦП) и гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК), 720 тыс. и 470 тыс. случаев соответственно [4]. Экономический ущерб, ежегодно наносимый хроническим гепатитом В только для России, составляет десятки миллиардов рублей [5, 6]. Несмотря на то, что в конечном итоге мишенью вирусов гепатита В и С является гепатоцит, они относятся к разным семействам и имеют свои особенности.
Общая характеристика
Вирус гепатита В (HBV) — представитель семейства Hepadnaviridae — небольших оболочечных, преимущественно гепатотропных ДНК-вирусов. У хозяина вирус реплицируется и собирается исключительно в гепатоцитах, а вирионы высвобождаются через клеточный секреторный путь. Циркулирующий вирион состоит из оболочки и нуклеокапсида, который содержит частично двухцепочечную, расслабленную, кольцевую ДНК. Идентификационный рецептор HBV идентифицирован как полипептид-котранспортирующий таурохолат натрия, что объясняет гепатотропизм HBV [7].
Во время персистирующей, длительной инфекции могут возникать варианты HBV. Некоторые варианты способны обойти диагностические, профилактические и терапевтические меры. Это исключительное геномное разнообразие, наряду с высокой способностью к репликации, позволяет HBV адаптироваться к различным хозяевам. На основе эволюционного анализа в настоящее время описано восемь подтвержденных (A-H) и двух предварительных генотипов (I-J) и почти сорок субгенотипов [8]. Вирус гепатита В впервые был обнаружен B. S. Blumberg в 1965 г. при изучении сыворотки пациентов с лейкозом [9], в связи с чем всемирный день борьбы с гепатитом В отмечается в честь дня его рождения — 28 июля.
Вирус гепатита С (HCV) — представитель семейства Flaviviridae рода Hepacivirus, впервые описан в 1989 г. Это сферический оболочечный вирус, под его оболочкой находится нуклеокапсид, в который упакован геном HCV — одноцепочечная линейная РНК [10].
Так же, как и вирус гепатита В, вирус гепатита С имеет генетическое разнообразие. В настоящее время классифицируется на 8 генотипов и 86 подтипов.
Новый генотип HCV, генотип 8, был недавно идентифицирован у 4 эпидемиологически несвязанных пациентов из штата Пенджаб в Индии. Генотипы далее подразделяются на подтипы. На сегодняшний день описано 86 подтвержденных подтипов HCV, возможно, будет идентифицировано еще больше генотипов и подтипов [11].
В качестве основного механизма повреждения печени при HCV-инфекции рассматривается иммуноопосредованное повреждение гепатоцитов. Также вирус обладает способностью к внепеченочной репликации, что может приводить у отдельных пациентов к развитию системных проявлений [12].
Внепеченочные системные проявления
Нарушения иммунитета, приводящие к аутоиммунитету, могут быть вовлечены в развитие внепеченочных проявлений [13]. Одним из таких явлений является криоглобулинемия, которая может быть вызвана многими причинами, но чаще всего описывается у пациентов с HCV. В двух исследованиях у 36–54% пациентов с HCV обнаруживались криоглобулины, а у 25% — клинические симптомы, связанные с криоглобулинемией. Основные клинические проявления включают кожный васкулит с пальпируемой пурпурой (18–33%), артралгию-миалгию (35–54%), невропатию (11–30%) и почечные осложнения, такие как гломерулонефрит (27%) [14].
Кроме этого, имеются сведения, что HCV является лимфотропным вирусом. Хроническая стимуляция вирусного антигена может играть важную роль в нарушении пролиферации В-клеток [15], в связи с чем лимфопролиферативные заболевания сопровождают вирусный гепатит С.
Одним из внепеченочных проявлений является синдром Шегрена. Было показано, что этот синдром связан с наличием аутоантител к мускариновому рецептору типа 3 (M3R).
Обнаружено, что антимускариновые антитела имеют решающее значение для дисфункции экзокринных желез, а также для других сопутствующих вегетативных дисфункций (судомоторная, кардиовагальная и адренергическая функции). Сердечно-вагусная дисфункция идентифицируется как одна из основных причин повышенной смертности при хронических заболеваниях печени. Механизм сердечно-вагусного поражения при HCV до сих пор неизвестен. Были выдвинуты некоторые гипотезы, такие как иммуноопосредованный, общий патофизиологический механизм гепатоцеллюлярного повреждения и вегетативной дисфункции миокарда. Помимо сердца, M3R также присутствуют в клетках-предшественниках гепатоцитов. Этот пул клеток имеет особое значение для регенеративного процесса при болезнях печени, включая хроническую инфекцию HCV. Поэтому стимуляция блуждающего нерва, опосредованная через M3R, имеет решающее значение благодаря увеличению пула клеток-предшественников гепатоцитов.
Инфекция HCV является доказанным независимым фактором риска развития сердечно-сосудистых нарушений и более высокой смертности от сердечно-сосудистых заболеваний. Вирусная нагрузка HCV была независимо связана с ранним, бессимптомным атеросклерозом сонных артерий, с более высоким риском заболевания периферических артерий. В соответствии с этим выводом несколько исследований показали увеличение показателей общей и сердечно-сосудистой смертности среди пациентов с обнаруживаемой РНК HCV. HCV-инфекция также была независимым предиктором инсульта и цереброваскулярной смерти. В одном исследовании стимуляция HCV toll-подобных рецепторов индуцировала CD4+Th1-ответ, который стимулировал макрофаги к продуцированию провоспалительных цитокинов (в большей степени ИЛ-1 и фактора некроза опухоли-альфа), что представляет собой фактор риска для миокардита и кардиомиопатий [16].
HCV обнаружен в астроцитах и макрофагальных микроглиальных клетках иммунными методами, но попытка непосредственного заражения астроцитов предполагает, что взаимодействие HCV с астроцитами приводит к прямой нейротоксичности посредством индукции ИЛ-18. У ряда пациентов описывается дисфункция щитовидной железы в результате аутоиммунного процесса. Недавно было подтверждено, что HCV может непосредственно инфицировать in vitro клетки щитовидной железы человека [14].
Внепеченочные проявления при гепатите В менее выражены, до сих пор остаются вопросы по патогенезу повреждения других органов. Тем не менее внепеченочные проявления, в том числе заболевания почек, узелковый периартериит или дерматологические заболевания, такие как распространенный акродерматит, встречаются у 10–20% инфицированных HBV пациентов.
Связанные с HBV заболевания почек могут привести к хронической болезни почек (ХБП). Их можно классифицировать как иммунный комплексный гломерулонефрит (мембранозная нефропатия или мембранопролиферативный гломерулонефрит) и связанный с иммунным комплексом васкулит (узелковый периартериит или криоглобулинемический васкулит). Хотя патогенный механизм этих почечных проявлений неясен, отложение HBV-связанных иммунных комплексов, репликация HBV в эпителии почечных канальцев, которая может способствовать апоптозу почечных канальцев, инсулинорезистентность, связанная с HBV, и окислительный стресс могут способствовать почечной дисфункции [17].
Хронический гепатит С является системным заболеванием с внепеченочными проявлениями, включая депрессию, которая зарегистрирована у одной трети пациентов с HCV-инфекцией, и, по оценкам, распространенность ее в 1,5–4,0 раза выше, чем у пациентов с хронической инфекцией вируса гепатита В или среди населения в целом. У пациентов с HCV-инфекцией и депрессией отмечается ухудшение качества жизни. Вызванный лечением клиренс HCV связан с улучшением депрессии и качества жизни [18].
У пациентов с вирусным гепатитом В чаще возникают психологические расстройства, но основные механизмы не выяснены. Все большее число исследователей начали уделять внимание проблемам психического здоровья у данной группы. Atesci с соавт. оценили частоту психических расстройств у 43 носителей вируса гепатита B (HBV) и 43 здоровых людей с помощью шкалы депрессии Бека. Они обнаружили, что носители HBV были более восприимчивы к психическим расстройствам, чем здоровые люди (30,2% против 11,6%) [14]. В апреле 2019 г. китайскими исследователями опубликованы данные о взаимосвязи депрессии и бессонницы с уровнем гормонов щитовидной железы (низким FT3,
* ГАУЗ КО ОКБСМП им. М. А. Подгорбунского, Кемерово
** ФГБОУ ВО КемГМУ Минздрава России, Кемерово
*** ГАУЗ КО ОКБ им. С. В. Беляева, Кемерово
Вирусные гепатиты В и С: сходство и различие/ М. С. Карягина, Е. Ю. Плотникова, Е. Н. Баранова, О. А. Воросова, М. А. Шамрай, С.Ф. Зинчук, К. А. Краснов
Для цитирования: Лечащий врач № 9/2019; Номера страниц в выпуске: 74-79
Теги: печень, вирусная инфекция, противовирусная терапия, вакцинация
Генотипирование вируса гепатита С (HCV) (определение РНК) (генотипы 1а, 1в, 2, 3а/3б)
Вирус гепатита С (ВГС) представляет собой небольшой (55-65 нм в размере) сферический РНК-содержащий вирус из семейства Flaviviridae. Он является причиной развития гепатита С.
ВГС состоит из основного генетического материала (РНК), окруженной защитной белковой оболочкой, а также липидной (жировой) оболочкой сотовой структуры, которая содержит два оболочечных белка — гликопротеины E1, E2, встроенные в липидные оболочки. Белки E1 и E2 обеспечивают проникновение вируса в клетку и закрепление в ней.
Геном HCV включает в себя одноцепочную РНК, имеющую 9600 нуклеотидных оснований.
Гепатит C имеет условную классификацию по структуре РНК и делят на генотипы и субтипы. Выделяет шесть генотипов по одному признаку и одиннадцать – по другому. По сути, генотип – это комплекс вирусов, которые в медицинской практике получили название «квазивиды». Они стремительно прогрессируют и развиваются, изменяются с невероятной скоростью, при этом абсолютно не восприимчивы к лекарственным средствам. Именно процессом «генотипирование» и объясняются сложности в разработке вакцины, которой на сегодняшний день попросту не существует в природе.
Наиболее распространен в мире генотип 1 (40-80 %). В Европе и России частота определения генотипов располагается в следующем порядке: 1b, 3ав, 2.
Геномы вируса значительно отличаются в разных странах мира и имеют различную чувствительность к препаратам интерферонов.
При хроническом гепатите С, ранее считавшемся неизлечимым, современная противовирусная терапия позволяет добиться удаления вируса из клеток печени, предотвратить тем самым развитие тяжелых осложнений – цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы.
Генотипирование РНК вируса гепатита С позволяет правильно назначить лечение и его продолжительность, спрогнозировать эффект от планируемой терапии.
Генотип 1 хуже поддается лечению, чем генотипы 2 и 3. У пациентов с генотипом 1в хронизация HCV –инфекции происходит в 90% случаев, в то время как у носителей генотипов 2а и 3а – только в 35-50%. Повышенные дозы препаратов интерферона рекомендованы для пациентов с 1-м и 4-м генотипами. Курс терапии у таких пациентов должен быть продлен до 48 недель даже при отсутствии вируса в крови более 24 недель. Если количество вирусных копий не снизилось на 2 порядка за 12 недель, значит, лечение неэффективно и его необходимо пересмотреть.
Генотипы 2 и 3 хорошо поддаются терапии в 80 % случаев, обычно это занимает 24 недели.
Лечение разрабатывается с учетом пола и возраста пациента, присутствующих у него симптомов, ранее проводимой терапии, структуры и функции печени, а также лабораторных показателей.
К сожалению, есть вероятность повторного заражения вирусным гепатитом С другого генотипа из-за отсутствия перекрестного иммунного ответа и стойкого иммунитета.
Показания к исследованию:
Когда назначается исследование?
Что может влиять на результат?
Генотип вируса гепатита С иногда не выявляется при вирусной нагрузке крови менее 200 копий /мл
Что значит, если в результатах генотипирования стоит «генотип не типируется»?
Это может быть по двум причинам — у Вас не типичный для нашего региона, «экзотический» генотип HCV или низкая концентрация вирусной РНК в крови. В первом случае, нужно переделать анализ в другой лаборатории, которая типирует генотип 4. Если результат будет прежним, то лечение проводят по схемам, эффективным в отношении генотипов 1, 2, и 3. Во втором случае нужно пересдать тест в диагностическом центре с более чувствительным оборудованием.
Как вирусы обманывают человека?
Метафорическая зарисовка. Представители различных генетических вариантов SARS-CoV-2 собрались за круглым столом и обсуждают план захвата мира. Рисунок в полном размере.
Автор
Редакторы
Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Вирусы умеют не только размножаться внутри клеток хозяина, но и прятаться от его иммунитета. Способов избежать фатальных встреч с оборонными силами организма существует множество, но один из самых хитрых (и потому особенно интересных) механизмов демонстрируют вирусы с измененными генетическими последовательностями. Эта статья расскажет, что такое генотипы и генетические варианты вирусов и почему так важно о них знать.
Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021
Эта работа опубликована в номинации «Вирусы и микроорганизмы» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.
Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.
Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.
Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Зачем нам знать о генетических вариантах вирусов?
Новости о коронавирусе на протяжении всего 2020 года оставались самыми читаемыми, а количество научных публикаций о SARS-CoV-2 почти в пять раз превысило число статей по другой «громкой» теме — системам CRISPR/Cas: по данным PubMed их уже больше 60 тысяч! И здесь важнее следить не столько за драматической статистикой заражений и исходов, сколько за потенциалом и способностями возбудителя. Ведь вирусы умеют мутировать и порождать таким образом новые генетические варианты [1].
Генетические варианты вируса — это геномы какого-то вида (или штамма) вируса, отличающиеся друг от друга по последовательности нуклеотидов, и эти отличия могут обусловливать появление новых штаммов. «Генотип», «субтип», «генетический вариант» — термины, отражающие степень геномных различий (в порядке убывания).
По мере накопления знаний по этой теме опасения ученых лишь крепли: мутации могут влиять как на вирулентность, так и на тяжесть протекания заболевания, развитие лекарственной устойчивости и вероятность повторного заражения [2].
У SARS-CoV-2 весной 2020 года выделяли 3 генотипа: A, B и C [1]. Но сейчас особое внимание обращают на некоторые генетические варианты этого вируса и их географическое распределение (рис. 1) [3]. Известно, что даже самое маленькое изменение в генетическом материале возбудителя способно сильно сказаться на протекании либо распространении заболевания. На что же могли повлиять мутации в геноме SARS-CoV-2?
Рисунок 1а. Схематическое изображение эволюции SARS-CoV-2
Рисунок 1б. Карта распространения генетических вариантов SARS-CoV-2
Например, единственная мутация в гене поверхностного белка (spike-белка), вызвавшая замену его 614-й аминокислоты — D614G, — способствовала распространению SARS-CoV-2 по миру [4], [5].
Другая мутация, C14408T, в последовательности, кодирующей вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), потенциально способна влиять на развитие лекарственной устойчивости [6], [7]. Но самым поразительным можно считать случай, когда у пациента один генетический вариант SARS-CoV-2 заместился другим [8]. Дело в том, что наша иммунная система выстраивает защиту, по сути, от определенного вирусного генотипа. Если же вирус меняется, организм, встречавшийся с его предшествующим вариантом, новый может и не узнать.
Однако можно чуть-чуть успокоиться: мутации SARS-CoV-2 хоть и устроили хорошую суматоху, но так и не показали пока явной клинической значимости — в отличие от изменений ряда других вирусов. О них и пойдет речь дальше.
Вирусы гепатитов и компания
Гепатиты
В 2020 году Нобелевскую премию по физиологии или медицине вручили за открытие возбудителя одного из гепатитов — вируса гепатита С (ВГС, HCV) [9]. Болезнь может протекать без видимых симптомов, но при этом вирус сильно поражает печень. В крайних случаях развивается цирроз или даже рак печени [10]. К счастью, уже есть эффективные средства от гепатита С: по словам нобелевского лауреата Харви Олтера, противовирусные препараты прямого действия позволяют излечивать 95–98% пациентов [9]. Так в чем же подвох?
Интересно, что ВГС генотипов 1 и 4 обычно хуже поддаются терапии и требуют более продолжительного лечения, чем 2 и 3 [12].
| Генотипы ВГС | Субтипы |
|---|---|
| Генотип 1 | 1a, 1b |
| Генотип 2 | 2a, 2b, 2c, 2d |
| Генотип 3 | 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f |
| Генотип 4 | 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j |
| Генотип 5 | 5a |
| Генотип 6 | 6a |
| Генотип 7 |
При этом из-за высокой генетической вариативности, то есть больших различий между вирусными генотипами (до 30–35%), против ВГС не получается создать эффективную вакцину. Проблема усугубляется тем, что для тестирования прототипов вакцин нужны небольшие модельные животные, а получить мышей, способных одновременно болеть гепатитом С и имитировать человеческий иммунный ответ на инфекцию, очень трудно. И наконец, для изучения вируса in vitro нужно нарабатывать заразные частицы ВГС, а способные на это клеточные культуры появились лишь недавно [14].
Секвенирование вирусного генома показало, что в России циркулирует рекомбинантный вариант ВГС (RF2k/1b), генетически сходный с генотипами 1 и 2 одновременно. Из-за такой маскировки детекция этого генотипа затруднительна, а значит, и лечение бывает менее эффективным [15].
Итак, чтобы эффективно справиться с гепатитом С, нужно определить генотип его возбудителя. Не менее важно знать и генотип вируса, вызывающего другой гепатит — гепатит B. Да, от ВГВ (HBV) существует прививка [16]. Но! Есть основания считать, что генотипы ВГВ, несмотря на относительно небольшую вариативность (около 8% генома), по-разному влияют на тяжесть заболевания [17], [18].
Стоит, однако, учитывать, что результаты исследований связи вирусных генотипов с особенностями течения болезни весьма противоречивы. Чаще всего это связано с недостаточным размером изученных выборок, что, в свою очередь, обусловлено сложностями массового генотипирования. Из-за этого, например, на Тайване развитие гепатоцеллюлярной карциномы связывают с ВГВ генотипа В, а в Японии и КНР — с ВГВ генотипа С [19]. Тем не менее некоторые авторы приходят к выводу, что генотип ВГВ вообще не имеет большого клинического значения [20].
Хоть пока и нет общих рекомендаций проводить генотипирование ВГВ, ряд ученых призывает сделать его обязательным, поскольку пангенотипной терапии в случае гепатита В не разработано, а эффективность лекарств порой разнится в зависимости от генотипа.
Детекция генотипа вируса может стать хорошим подспорьем для врачей как минимум в двух направлениях: в определении вероятности развития той или иной формы болезни у конкретного пациента и в персонализации лечения. Однако подобных исследований крайне мало, можно даже сказать, что это поле еще совсем не пахано.
Денге
Мы уже заметили, что при разработке вакцин необходимо знать и учитывать разнообразие генотипов вируса. В этом отношении яркими примерами могут служить подходы к производству вакцин от гриппа и менее распространенной болезни — лихорадки денге, о возбудителе которой мы сейчас и расскажем [21].
Рисунок 2. Географическое распределение эндемичных по вирусу денге районов в 2011 году
У вируса денге выделяют четыре серотипа, то есть четыре группы вирусов с общей антигенной структурой. Генотипов у этого возбудителя больше, соответственно, и отслеживать их сложнее. Увы, но знания серотипа порой недостаточно для качественной вакцинации. Например, низкую эффективность одной из проходивших клинические исследования вакцин против серотипа 2 можно объяснить большой вариативностью составляющих его генотипов [22].
Существует мнение, что если эффективность вакцин против денге в новых клинических исследованиях останется низкой, при создании вакцинных препаратов необходимо будет отталкиваться именно от результатов генотипирования [21]. Это нужно и для исключения возможного антителозависимого усиления инфекции в случае, если вакцина будет защищать не от всех серотипов/генотипов, с которыми может встретиться отдельный организм.
Примечание
Антителозависимое усиление инфекции (ADE, antibody-dependent enhancement) — феномен, при котором связывание вируса с cубоптимальными нейтрализующими или не нейтрализующими антителами способствует его проникновению в иммунные клетки с последующей репликацией в них. Из-за ADE непроверенные вакцины могут быть очень опасными: при встрече с инфекцией вместо обеспечения защиты некоторые из них способны утяжелять течение заболевания [23].
Подводя итог, можно сказать, что знание генотипов вирусов необходимо для отслеживания распространения заболеваний по миру, для их лечения, а также для получения эффективных вакцин. К сожалению, пока генотип-специфичная борьба с инфекциями сильно ограничивается в том числе и недостатком информации о вирусных штаммах.
Но как вообще появляется это штаммовое разнообразие?
Вирусная хитрость: механизмы изменения геномов
Вирусы способны изменять свои свойства внутри клеток хозяев и в результате становиться заразнее и опаснее. Впрочем, не стоит пугаться. Обычно вирусная эволюция протекает в сторону снижения летальности, поскольку вирусу, который не убивает своего носителя и почти не вызывает симптомов, намного проще распространиться в популяции. Хоть геномы вирусов и изменяются с довольно высокой частотой, на деле мутации чаще оказываются нейтральными, не влекущими заметных последствий для вируса и его хозяина. Очень немногие из них действительно вносят вклад в дальнейшую эволюцию [24].
В основе способности вирусов к изменениям лежат мутации и/или обмен генетическим материалом между разными вирусами, результаты которых закрепляются или не закрепляются давлением естественного отбора.
Мутация — это изменение последовательности нуклеотидов в определенном участке генома, нередко приводящее к изменениям структуры и/или функций организма или вируса. Мутации могут возникать из-за ошибок работы ферментов, создающих копии геномов, или под действием среды.
Когда одну и ту же клетку заражает два родственных вируса, могут образовываться гибридные вирусы, содержащие измененный по сравнению с родительскими формами генетический материал. Этот процесс называют рекомбинацией или реассортацией, если у вирусов сегментированный геном (в частицу он упаковывается отдельными сегментами типа мини-хромосом) [25].
Для справки
До введения термина «реассортация» в научный обиход рекомбинацией называли любой обмен генами, включая и те процессы, которые сейчас со знанием дела именуют реассортацией [25].
Реассортация очень напоминает появление детей у родителей: когда два разных вириона попадают в одну клетку и приступают к размножению, они могут обменяться частями геномов (рис. 3). В результате получится новая вариация (штамм) вируса, которая может значительно отличаться от своих предков [25]. Такие вирусы порой становятся неузнаваемыми для иммунной системы и распространяются, вызывая эпидемии и пандемии. Этот сценарий характерен, например, для вирусов гриппа. Некоторые исследователи винят в пандемии той же «испанки» именно вирусную реассортацию [26].
Рисунок 3. Реассортация вирусов, которая приводит к появлению штамма с измененным генетическим материалом
Благодаря мутациям и обмену генетическим материалом вирус может даже менять своего хозяина. Так SARS-CoV-1 от летучих мышей перешел в семейство виверровых (к мусангам и циветам), а затем и к людям. В начале 2000-х этот вирус вызвал эпидемию, охватившую 29 стран [28].
Новые генотипы могут возникать и в ходе лабораторных пассажей, когда вирусом последовательно заражают нескольких животных, выделяя из них новую чистую культуру возбудителя [29]. Такая процедура нужна, в частности, для тестирования противовирусных лекарств и вакцин.
Свойства вируса во время пассажей меняются ступенчато. В первых пассажах в основном обнаруживают вирионы, изменившие какой-то один генетический признак. Но с увеличением числа пассажей у подавляющего большинства вирусных частиц наблюдают изменение многих генетических признаков.
Кроме рекомбинации и мутаций, изменчивость вируса может быть обусловлена влиянием хозяина (host-controlled variation). Такие модификации не затрагивают генетический материал вируса и встречаются, например, у ДНК-содержащих бактериофагов, вирусов гриппа и Сендай. Клетка может влиять на характер синтезируемых в ней вирусных компонентов. Или в вирусную частицу могут попадать хозяйские белки и липиды. Поэтому при смене клетки-хозяина в структуре оболочки вириона меняются и антигены, с помощью которых организм узнает вирус.
Итак, образование новых вирусных генотипов — совершенно обычное явление, основанное на стандартных эволюционных процессах. Однако как нам эти генотипы детектировать?
Как выявляют генотипы вирусов?
Теперь, когда мы знаем, как возникают вирусные генотипы и как от генетического варианта возбудителя могут зависеть течение, распространение и лечение заболевания, перейдем к обсуждению лабораторных методов. Они позволяют нам определять, вирус какого генотипа вызвал болезнь у конкретного пациента. Рассмотрим методы детекции генотипов на примере вируса ВГС. В настоящее время лабораторные анализы, используемые в схемах диагностики и лечения гепатита C, представлены серологическими тестами для обнаружения антител к ВГС, молекулярными тестами для выявления и количественной оценки РНК ВГС, а также методами генотипирования возбудителя [30].
При первоначальной диагностике гепатита C учитывают симптоматику и уровни ферментов печени (особенно аланинаминотрансферазы, АЛТ) в крови. У пациентов с подозрением на гепатит C иммуноферментным анализом (EIA) [31] или хемилюминесцентным иммуноанализом (CIA) выявляют антитела к ВГС. В популяциях с низким риском инфицирования этим вирусом отрицательного результата EIA или CIA достаточно, чтобы исключить заражение гепатитом C. Но важно помнить, что у пациентов с ВИЧ или последней стадией почечной недостаточности серологические тесты на антитела к ВГС могут давать ложноотрицательные результаты. Если тест выявил антитела или допускается возможность ложноотрицательного результата, в организме пациента должны искать РНК самогό вируса.
Определение статуса инфекции ВГС, решение о лечении и мониторинг ответа на него зависят от трех важных факторов: обнаружения РНК вируса гепатита С, ее количества и вирусного генотипа. Для оценки всех этих параметров есть несколько коммерческих тест-систем. Они различаются по диапазону обнаружения, чувствительности, специфичности, стоимости и сложности использования.
Выявление РНК вируса гепатита С основано на принципе амплификации нуклеиновых кислот [32], причем применяют здесь комбинацию разновидностей полимеразной цепной реакции (ПЦР): качественную ПЦР, опосредованную транскрипцией амплификацию (ТМА) и количественную ПЦР в реальном времени.
Генотипирование ВГС необходимо для назначения оптимальной схемы лечения. Генотип этого вируса можно определить несколькими методами, нацеленными на гены вирусных белков (E1, NS4 и NS5) и на 5′-нетранслируемую область (5′-UTR) генома ВГС. Они включают простую ПЦР, гибридизацию с генотип-специфичными зондами и ПЦР в реальном времени. Однако для более точного определения вирусного генотипа следует прибегать к методам секвенирования нового поколения (NGS) [33].
Наш проект HaploSense
Как мы уже поняли, определять генотипы сложно, поскольку практически нет быстрых и доступных тестов. Наша команда студентов и аспирантов под названием Moscow 2020 решила изменить эту ситуацию.
На международном конкурсе iGEM в этом году мы представили проект детектора генотипов вируса гепатита С. В основе детекции лежит система CRISPR-Cas, с которой многие читатели уже знакомы [34], [35], а принцип работы напоминает популярные методы детекции SHERLOCK (Specific High sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing) и DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) [35]. Но есть и важные отличия, о которых сейчас расскажем.
В своей тест-системе мы использовали самый маленький из открытых к этому моменту Cas-белков — CasX (или Cas12e) из Deltaproteobacteria: он состоит из 980 аминокислотных остатков по сравнению с 1300 у Cas9 [36]. Как и Cas13a с Cas12a, маленький CasX обладает коллатеральной нуклеазной активностью (может неспецифически резать нуклеотидные последовательности, с которыми встретится после связывания с мишенью): она позволяет разрезать олигонуклеотиды с флуоресцентными метками после прикрепления белка к геному вируса. Но ВГС — РНК-содержащий вирус, поэтому для связывания с ним CasX нужно провести дополнительную реакцию: с помощью обратной транскрипции получить комплементарную последовательность ДНК.
Итак, в нашей системе четыре основные стадии (рис. 4):
Пока наша тест-система предполагает определение только одного генетического варианта ВГС — рекомбинантного RF2k/1b, распространенного в России. В 2020 году доступ в лабораторию для нас был закрыт, поэтому систему предстоит еще собрать и протестировать. Если все лабораторные испытания пройдут успешно, мы планируем расширить специфичность системы на все генотипы вируса, не умножая при этом количество приборов.
Рисунок 4. Схема детекции генотипов ВГС с помощью HaploSense
Такая на первый взгляд сложная система позволит определять генотип возбудителя гепатита С быстрее, вне специально оборудованной лаборатории и с не меньшей точностью, чем ПЦР. Мы надеемся, что когда-нибудь такой подход поможет сделать тестирование массовым и доступным.
Подробнее о iGEM
В 2020 году команда студентов с биологического факультета МГУ представила свою разработку на самом престижном международном конкурсе по синтетической биологии — The International Genetically Engineered Machines competition (iGEM). С английского название переводится как «Международное соревнование генно-инженерных машин». Это соревнование учредили в 2003 году в Массачусетском технологическом институте (Бостон, США). Школьники, студенты и аспиранты со всего мира и с разным академическим бэкграундом, начиная от журналистов и экономистов и заканчивая айтишниками и биологами, собираются в команды, в течение года работают над актуальной задачей и представляют свои проекты на осенней, финальной конференции Giant Jamboree. Конкурс iGEM уникален тем, что формирует открытое сообщество людей, которые обмениваются друг с другом и миром своими наработками. Выгодно отличают конкурс также комплексность и разноплановость проектов: упор делается на применение инженерных принципов и подходов, использование методов моделирования, обсуждение и проработку проекта с потенциальными пользователями и экспертами из разных областей (науки, бизнеса, права, государственного управления и т.д.). Образовательная деятельность, популяризация наук, налаживание между учеными и обществом мостов с целью обсуждения актуальных проблем — все это тоже входит в задачи команды. В этом году из-за пандемии конкурс проходил онлайн. Ядро нашей команды составляли студенты биологического факультета МГУ, которые получили бесценный опыт и выиграли золотую медаль. Однако подробнее об iGEM мы поговорим с вами в следующий раз [39].
Работа в команде
В конце марта 2020 года команда Moscow 2019 собрала новый состав для участия в конкурсе iGEM (рис. 5). Тогда впервые встретились незнакомые друг другу люди с общим желанием — создать проект в области синтетической биологии, который мог бы что-то изменить в мире.
Идея нашего проекта появилась только спустя полтора месяца, в начале мая. iGEM предлагает полную тематическую свободу: можно делать хлеб из дрожжей на Марсе, очищать воду бактериями, синтезировать натуральную краску для волос или разрабатывать системы мониторинга заболеваний. На выбор темы для нашего проекта сильно повлиял руководитель команды, Алексей Константинович Шайтан. Его лаборатория использует в работе системы CRISPR-Cas, а на их основе можно создавать детекторы заболеваний. Пандемия COVID-19 только начиналась, но уже было ясно, что SARS-CoV-2 необходимо выявлять быстро, массово и с высокой точностью. Так мы и создали наш проект — с целью детектировать генотипы коронавируса.
Очень важное требование конкурса — актуальность разработки. Другими словами, важно было понять, что наш проект нужен людям и его будут использовать. Этим проекты iGEM сильно отличаются от рутинной работы научных лабораторий. Именно поэтому мы встречались с экспертами, писали письма главному эпидемиологу Министерства здравоохранения, Николаю Ивановичу Брико, размещали посты в социальных сетях. Обратная связь полностью изменила наш проект: HaploSense переориентировался на детекцию генотипов вируса гепатита С.
С другой стороны, важен был сам детектор — как он будет работать, выглядеть, сможем ли мы его вообще собрать. Здесь нам на помощь пришел спонсор, компания BIOCAD. Эксперты компании консультировали нас относительно идеи проекта и ее реализуемости в столь короткие сроки. Они рассказали нам, как готовить патенты и выводить продукт на рынок. А это далеко не простые процессы.
В результате мы проанализировали гору тематической литературы, смогли придумать целостную систему на основе технологий CRISPR-Cas, провели ее моделирование и биоинформатический анализ.
Надо сказать, что организаторы iGEM помогают командам на протяжении всего пути: устраивают семинары, знакомят со специалистами, создают удобные платформы. А особенно поддерживают взаимодействие между командами. Все полгода мы общались и встречались с мотивированными ребятами из Америки, Эстонии, Индии, Франции, Германии и России (в этом году в конкурсе участвовали две команды из нашей страны). После таких встреч мы понимали, что можем сделать хороший, качественный проект, даже будучи студентами.
Рисунок 5. Команда iGEM Moscow 2020
Пандемия, конечно, сыграла свою роль в работе нашей команды: мы работали дистанционно и встречались друг с другом офлайн всего четыре раза. По-настоящему сплоченными мы стали, когда приблизились конкурсные дедлайны. Мы уложились в срок благодаря слаженной работе команды. Одному человеку было бы невозможно справиться: кроме разработки идеи проекта, моделирования и проведения экспериментов нам предстояло сделать сайт с описанием проекта, два видео о команде и работе, заполнить форму безопасности, написать обзор по теме, да и это еще не все. Именно поэтому проект iGEM — прежде всего командная работа.
Итоги конкурса подводятся осенью, в начале ноября, на Giant Jamboree — огромной конференции, где команды, профессора, лекторы и судьи собираются, чтобы обсудить проекты, подметить их сильные и слабые стороны, сформировать новые коллаборации и просто хорошо провести время. Это финал iGEM: проекты уже подготовлены, критерии конкурса соблюдены. Казалось бы, можно выдохнуть… Но здесь же команды встречаются с судьями — исследователями, которые будут оценивать проекты и детально их рецензировать. Мы, конечно, тоже общались с судьями (в этом году онлайн): в воскресенье, в 17:00, нас спрашивали, почему мы использовали LAMP, сколько тест-полосок будем применять, ну и много чего другого. А после нашу команду ждала неделя, полная лекций по синтетической биологии и общения с коллегами со всего мира, а также викторины по синтетической биологии и церемония награждения. В итоге мы выиграли золотую медаль и создали хороший проект, который продолжим развивать и, надеемся, доведем до состояния полноценной тест-системы, подходящей для обычных поликлиник.
Мы советуем всем молодым исследователям принимать участие в iGEM. Этот конкурс стал для нас лучшим событием 2020 года. Создать проект с нуля возможно, нужно только желание!